EU-Click新生RNA捕获试剂盒
【产品简介】
本试剂盒的工作原理为，采用5-乙炔基尿苷（5-ethynyl uridine，EU）对活细胞/活体中新合成的RNA进行代谢标记，随后通过点击化学（Click Chemistry）在插入RNA分子的EU上特异性连接生物素，并利用链霉亲和素磁珠高效、特异性富集生物素化的新生RNA。通过本试剂盒捕获的新生RNA可进一步用于qPCR及RNA-seq等下游分析。
结合合理的标记时间设计，该试剂盒不仅可以实现新生RNA的定量检测，还可用于研究RNA的转录活性及稳定性/降解动力学。
此外，若同时关注稳态总RNA情况，可在点击化学反应之前，对部分已提取的总RNA进行total RNA-seq，进而实现对同一份样本稳态总RNA和新生RNA的同步检测。
【产品组分】
试剂盒 | 组分名称 | YT-4101-12 | YT-4101-48 |
试剂盒1 | Click-Buffer-2 | 120 μL | 120 μL×4 |
保护剂 | 600 μL | 600 μL×4 | |
链霉亲和素磁珠 | 240 μL | 240 μL×4 | |
2×Wash Buffer* | 1320 μL | 1320 μL×4 | |
溶液A | 960 μL | 960 μL×4 | |
溶液B | 960 μL | 960 μL×4 | |
试剂盒2 | EU (1 M)** | 100 μL | 100 μL×4 |
生物素 | 36 μL | 36 μL×4 | |
硫酸铜 | 36 μL | 36 μL×4 | |
Click-Buffer-1 | 72 μL | 72 μL×4 |
*Wash Buffer稀释：可用DEPC水。
**此处提供的EU用量以T25培养瓶培养细胞的需求量为准，若需要更多的EU试剂，可单独购买。
【运输与存储】
试剂盒 | 运输 | 存储 | 保质期 |
试剂盒1 | 冰袋运输 | 2~8℃保存 | 18个月 |
试剂盒2 | 干冰运输 | -25~ -15℃保存 |
【产品优势】
l 动态监测RNA合成、降解全过程，挖掘静态测序找不到的基因调控新机制；
l 精准建模刺激条件下转录、降解双重调控的RNA动态变化，量化双向调控贡献；
l 分离新生RNA信号，降低背景干扰，低丰度应答基因也能精准识别，提升差异分析精度；
l 摒弃复杂Pull-down富集步骤，操作简单省时，减少人工操作误差；
l 温和标记无细胞毒性，不干扰细胞原有生理转录状态，数据更贴近体内真实情况；
l 适配活细胞、活体动物、植物等多类活体样本；
l 捕获产物直接兼容建库、测序、qPCR等下游实验，一站式完成转录动力学研究；
l 标记效率稳定，适合大批量时间梯度动力学样本检测。
【注意事项】
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩及一次性手套，在洁净实验区域内进行实验操作，且使用无RNA酶的试剂与耗材；
2. 试剂盒的各个组分，在使用前需完全解冻并充分混匀，试剂待用期间需放置于冰上。
【自备材料】
1. RNA提取：Trizol或RNA提取试剂盒等相关试剂；
2. RNA质控：Nanodrop、Qubit荧光计、Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效产品；
3. 其他：磷酸盐缓冲液、无水乙醇、无菌超纯水、无菌无酶水，低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
【实验流程】
EU-Click新生RNA捕获试剂盒实验流程示意图
【操作步骤】
一、 EU孵育（下述分别以细胞、动物、植物样本为例进行EU孵育浓度与时间的探讨，若涉及其他样本，请参考文献资料或过往的实验数据）
1.1 细胞样本
细胞密度在70%-90%或细胞密度达到实验设计的需求，可进行EU孵育。为保证较好的实验结果，一般建议进行新生RNA捕获的细胞量不低于1×106。
用完全培养基稀释EU至合适浓度，并用含有EU的完全培养基培养细胞（对细胞样本，常见的EU使用终浓度为1 mM），孵育2小时。针对不同细胞及不同的实验目的，可参考相关文献报道，以调整合适的EU孵育浓度及时间。
初次实验时，可按照下述推荐EU终浓度和孵育时间进行预实验。
EU浓度（mM） | 孵育时间（H） |
2 | 2 |
1 | 4 |
0.5 | 6-8 |
0.1 | 10-24 |
1.2 活体动物
用PBS配制一定浓度的EU溶液，按照200-400 mg/kg的用量，根据动物体体重进行注射或灌胃。具体EU用量与实验动物的种类、体重以及使用方式有关，需参考相关文献。初次使用时建议对EU的使用浓度进行摸索，若无相关参考文献，可使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死实验动物（如小鼠），取出所需组织，进行后续实验。
1.3 植物样本
根据植物体的培养环境添加EU进行孵育，用量可参考相关文献，对于液培样本，可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时。
二、RNA提取（下述以Trizol方法为例，亦可使用RNA提取试剂盒进行提取）
2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 mL Trizol将细胞裂解，置于无酶离心管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，用无酶PBS清洗组织样本2-3次，置于1 mL Trizol中，使用研磨仪研磨直至看不到组织块，后置于无酶离心管中，室温静置5 min；
2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；
2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；
2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；
2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；
2.6 重复步骤2.5；
2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。
三、点击化学反应
3.1 点击化学反应液的配制（需现用现配）
试剂组分 | 体积 |
生物素 | 2.5μL |
硫酸铜 | 3μL |
Click-Buffer-1 | 6μL |
Click-Buffer-2 | 10μL |
保护剂 | 50μL |
PBS | 928.5μL |
Total | 1000μL |
3.2 向2.7步骤中得到50 μL DEPC水溶解RNA中加入150 μL点击化学反应液，涡旋混匀；
3.3 冰上静置30 min；
3.4 向3.3步骤的反应液中加入1 mL Trizol，涡旋混匀；重复2.2-2.6步骤中RNA提取的过程，弃上清且待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。
四、链霉亲和素磁珠（SMB）的准备
4.1 将链霉亲和素磁珠涡旋振荡以使其充分悬浮，注意不要离心，以防磁珠沉降；
4.2 磁珠用量：20 μL链霉亲和素磁珠/样品。对于多个样品（n），可一次洗性吸取n×20 μL的链霉亲和素磁珠至一个离心管中。加入1倍体积的2×Wash Buffer（n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min，后置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；
备注：
1、使用水平旋转仪的目的在于防止磁珠的自然沉降，亦可使用具有相同功能的仪器以让磁珠保持混匀；
2、因不同磁力架磁力大小不同，磁珠吸附时间会有所差别。一般情况下1-3min，至磁珠完全吸附于离心管侧壁并至溶液澄清后即可。
4.3 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的2×Wash Buffer（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，后置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.4 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的溶液A（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.5 重复4.4步骤；
4.6 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的溶液B（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；
4.7 重复4.6步骤；
4.8向装有磁珠的离心管中加入2.5倍体积的2×Wash Buffer（2.5×n×20 μL）重悬。
五、新生RNA捕获
5.1向第三步中得到的RNA样本中，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；
5.2涡旋混匀后室温孵育20 min，将离心管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；
5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。此时新生RNA已经被链霉亲和素磁珠捕获，通过本试剂盒捕获的新生RNA可用于RT-qPCR，RNA-seq等下游实验。
