新生RNA捕获与测序
1. 什么是新生RNA？
新生RNA，顾名思义，是指刚刚被RNA聚合酶转录合成、尚未经历完整的转录后加工的RNA分子。它可以被视为RNA的“初稿”或“半成品”。
其核心特征包括：
正在合成中：它们仍然与DNA模板、RNA聚合酶及其相关的转录复合物结合在一起。
未成熟：缺乏成熟的RNA所具备的许多特征。例如：
5'端带有三磷酸基团：而成熟mRNA的5'端有一个特殊的“帽子”结构（7-甲基鸟苷帽）。
包含内含子序列：尚未被剪接体切除。
3'端不完整：尚未被切断并加上多聚腺苷酸尾（Poly-A tail）。
寿命极短：新生RNA非常不稳定，要么迅速被加工成成熟RNA，要么被细胞质量控制系统降解。
重要区分：
新生RNA (Nascent RNA) vs. 成熟RNA (Mature RNA)：成熟RNA是经过剪接、加帽、加尾等加工后，可以行使功能（如指导蛋白质合成或作为非编码RNA）的最终产物。我们常规的RNA测序（如RNA-Seq）主要检测的是成熟RNA的丰度，它反映了基因表达的最终输出结果。
新生RNA vs. 初始转录本 (Primary Transcript)：这两个术语非常接近，有时可以互换。但严格来说，“初始转录本”强调转录完成后但尚未加工的RNA状态，而“新生RNA”更强调其“正在合成中”的动态过程。
因此，研究新生RNA就是直接窥探转录机器的工作现场，而不是仅仅分析其产出的最终产品。
2. 新生RNA研究的意义？
研究新生RNA的意义极为重大，因为它将基因表达研究从静态的、结果性的水平提升到了动态的、机制性的水平。其主要意义体现在以下几个方面：
揭示转录调控的精确机制：
成熟RNA的丰度是转录（合成）和降解两个过程共同作用的结果。通过同时测量新生RNA和总RNA，可以区分转录速率的变化和RNA稳定性的变化，从而精确判断调控是发生在转录层面还是转录后层面。
例如，一个基因的成熟mRNA水平升高，可能是由于转录加快，也可能是由于其降解变慢。只有测量新生RNA才能确定真正原因。
发现并研究瞬时的、不稳定的转录事件：
细胞中存在大量转录但迅速被降解的RNA，例如启动子近端暂停的RNA、增强子RNA（eRNA）等。这些RNA几乎不存在于成熟RNA池中，但它们在基因调控中扮演关键角色（如调控染色质状态、转录暂停与释放）。新生RNA研究是捕获这些“暗物质”的主要手段。
绘制全基因组范围内RNA聚合酶的“工作地图”：
通过新生RNA测序技术（如PRO-seq、NET-seq），可以以极高的分辨率精确定位所有活跃的RNA聚合酶在基因组上的位置、密度和方向。这为了解转录起始、暂停、延伸和终止的动力学提供了前所未有的视角。
理解非编码区域的功能：
绝大多数基因组是非蛋白质编码区，但其中包含大量的调控元件（如增强子、启动子）。这些区域会被特异性地转录产生增强子RNA（eRNA）。研究新生RNA是发现和鉴定这些功能性非编码转录本的最有效方法，极大地推动了我们对基因组“暗物质”功能的理解。
在疾病研究与药物开发中的应用：
许多疾病（如癌症、神经退行性疾病）的根源是基因表达的失调。新生RNA研究可以帮助 pinpoint（精确定位）失调究竟是发生在转录速率、转录暂停，还是RNA稳定性上，从而为开发靶向特定转录步骤的药物提供新的靶点和思路。
3. 新生RNA研究的方法？
研究新生RNA的关键在于特异性地富集或标记这些短命的、与染色质结合的RNA分子，同时排除大量成熟的、游离的RNA的干扰。以下是主要的研究方法，从经典到现代：
实验方法 | 反应原理 | 产品优势 | 产品劣势 |
染色质结合的RNA（CB-seq） | 1. RNA聚合酶II介导的转录发生在染色质上； 2. 通过细胞核分离和染色质洗涤，富集与染色质结合的RNA。 | 能够捕获与染色质紧密相关的RNA，反映转录原位过程； 适合研究共转录剪接、RNA加工等事件。 | 并非是新生RNA会将结合位点的RNA全部抓取，导致信号复杂； 实验流程中需进行核分离、染色质洗涤等步骤，操作繁琐； 分辨率相对较低（150–300 nt）。 |
Pol II结合的RNA（NET-seq） | 1. 利用RNA–DNA–RNA polymerase三元复合物稳定存在的原理捕获新生RNA； 2. 使用对Pol II磷酸化状态特异的抗体（如Ser2P和Ser5P）进行免疫共沉淀； 3. 分离与不同修饰状态Pol II结合的新生RNA分子。 | 无需放射性标记； 对Pol II延伸态的动态调控研究尤为适用。 | 仅适用于真核生物Pol II转录产物，不能捕获Pol I或Pol III转录的RNA； 无法区别新生RNA和非转录RNA（如某些snRNA）； 依赖抗体质量，抗体特异性和亲和力直接影响结果； 样本处理时间敏感，易影响转录态原貌。 |
核苷类似物体外标记（如，GRO-seq） | 1、在体外用溴标记的NTP对分离的细胞核进行处理（涉及细胞核分离和人为抑制转录），紧接着回复转录进程，免疫纯化捕获。 2、BrUTP是常用的体外标记核苷类似物。 | 可在不依赖成熟RNA剪接或加工的前提下捕获新生RNA； 能用于测量转录速率、停顿位点等。 | BrUTP处理对细胞状态要求高； 需核分离+体外转录，人为干扰较大； 不适合微生物、原核生物或细胞数量有限的样本； 操作步骤复杂，需严格优化实验条件。 |
核苷类似物体内标记（如，SLAM-seq，STARClick-seq） | 1. 通过在活细胞中加入核苷类似物（如4sU或5EU），被转录进RNA中； 2. 后续通过化学修饰（如IAA诱导的硫代脱除）或click chemistry反应实现标记RNA的分离、富集与测序； 3. 可定量转录和RNA半衰期。 | 4sU： 具有较高的标记效率，适合哺乳动物细胞； 可在多个时间点采样，研究RNA动力学变化； 5EU： 无需避光处理，操作更方便； 适用范围更广，可用于哺乳动物、植物、病毒体、细菌等多种系统； 对细胞毒性低，适合长期处理。 | 4sU： 全流程需避光，实验条件要求高； 培养液需频繁更换，适配不同细胞需重复优化； 长时间培养可能抑制细胞活力； 可能引发突变或转录干扰； 当前尚无成熟商业化试剂盒用于非哺乳类生物的新生RNA标记； 5EU： Click反应存在非特异性结合的风险； 商业化试剂盒适配性有限。 |
4. 目前可提供的技术服务项目
基于核苷类似物体内标记的GRO-seq
基于4sU核苷类似物体内标记的SLAM-seq
基于EU核苷类似物体内标记的EU-seq
